波音727-100C于1964年8月对外发布，并在727机身上作出重要改动。727-100C设有高86呎、宽134呎的货门，加强了地板厚度，最多可装载八个集货箱。飞机所有机门和紧急逃生门并没有改动。
波音727-100C能够根据客货量需求，改装为客机、货机或客货混合型，只需两小时便完成改装。-100C的在双座舱配置下，载客量为94人，货机型最多可负载36,750磅的货物；而客货混合型则可同时运载52人及四个集货箱共24,000磅的货物，飞机前面为货舱，后面为客舱。-100C最初的起飞重量为160,000磅，但经过强化中心剖面和起落架后，提升至169,000磅。
波音727-100C的首个客户为西北东方航空，接着是汉莎航空、联合航空、布兰尼夫国际航空、泛美航空、美国东方航空和环球航空。首架727-100C于1965年12月30日首飞，翌年4月取得适航证，4月13日交付给西北东方航空。
